Химическое тестирование — исследование изменения цвета различных макро- и микроскопических структур грибов под действием некоторых химических реактивов. Используется при идентификации образцов грибов для различения таксономических групп. Таксономической признаком может быть как положительный или отрицательный результат теста, так и вариации в изменении окраски при положительных реакциях, поскольку один и тот же реактив может давать различную окраску в различных видов грибов.

Могут проводиться простые тесты по выявлению характерных реакций мякоти плодового тела в целом или микроскопические исследования, обнаруживающие цветные реакции гиф, спор, базидий и других элементов трам или мицелия. Тесты могут проводится на свежих грибах, а некоторые и на гербарных образцах.

Значение и история метода

Макроскопические признаки плодовых тел, а иногда и признаки, выявляемые при микроскопическом исследовании могут быть недостаточными для однозначного определения. В таких случаях используют цветные химические реакции как дополнительный критерий таксонов.

Аналитические реактивы применяемые в большинстве случаев не являются специфическими для определенных веществ или комплексов веществ, содержащихся в грибах, однако они часто оказываются специфическими для определенных таксонов грибов, и позволяет широко использовать метод. Некоторые из используемых реакций являются специфическими, например, положительная реакция с бензидином и α-нафтолом указывает на наличие в мякоти гриба фермента лакказу, с фенолом — тирозиназы, а тест на амилоиднисть позволяет не только определить наличие в клетках специфических полисахаридов (глюканов), но и сделать определенные выводы о строении их макромолекул.

Впервые химический метод был применен в 1866 финским ботаником В. Нюландер для систематики лишайников. Нюландер заметил, что разные виды по-разному реагируют на действие растворами щелочей, гипохлоритов, йода, солей железа и другими реактивами. Позже Мюллер изучал действие химических реактивов на полипорови грибы и обнаружил появление фиолетовой окраски в Hapalopilus nidulans с аммиаком, Харлей открыл исчезновения фиолетовой окраски мякоти млечников оливково-черного под действием щелочи. На протяжении всего XX века действие химических реактивов на грибы изучалось многими известными микологами (Мельцер, 1924; Шеффер и Меллер, 1938; Кюнер и Романьези, 1953; Зингер, 1951, 1962, 1969, 1975; Майкснер, 1975; Вассер, 1980, 1992) . Полные данные о цветных химические реакции грибов содержатся в работах Кюнера и Романьези, Зингера (1975), Майкснера, Вассера.

По отношению к химического метода среди микологов существуют два противоположных мнения:

  • На основании только химических реакций описываются новые таксоны, иногда даже роды, при этом совершенно не учитываются другие критерии, особенно при росте грибов.
  • Некоторые же ученые не придают значения метода как дополнительном критерия таксонов.

С. П. Вассер (1980) приводит две цитаты, характеризующие оба существующие подходы: «Время от времени делаются попытки использования химических опытов для определения видов грибов и лишайников, часто вызывает бурю протестов. Однако в группе, которая представляет сложность для классификации и количество признаков которой небольшая или, наоборот, очень разнообразна, поступления дополнительных сведений имеет только приветствоваться. »- А. Берджес

«Химический метод является одним из удобных, быстрых и надежных, он дает дополнительную информацию в суждениях о виде и другие таксоны, его следует широко использовать, но обязательно вместе с другими методами систематики, особенно морфологическими.» — А. М. Окснер

Реактивы, которые чаще всего используются (для макрореакций)

Даны примеры цветных реакций, характерные для порядка Agaricales, реакции для других таксонов могут отличаться.

  • Аммиак (жидкий раствор или пары нашатырного спирта) дает зеленый, реже желтый цвет.
  • Анилин (в виде водных растворов солей) при положительной реакции дает окраски красных, желто-оранжевых или оливковых тонов.
  • Бензидин (спиртовой раствор) дает голубую окраску, что свидетельствует о наличии лакказу. Реагент является сильным канцерогеном, поэтому его на практике заменяют в -толидином (диметилбензидином), который значительно безопаснее и дает аналогичную реакцию.
  • Гваякол (спиртовой раствор или настойка семян растения Guajacum officinale) дает окраску в сине-зеленые, голубовато-серые, оливковые или красно-коричневые тона.
  • Концентрированные растворы кислот могут давать различные цветовые реакции, используются на свежем материале:
    • 60-70% серная кислота,
    • 65% азотная кислота,
    • 25% соляная кислота,
    • молочная кислота.
  • Лактофенол — смесь равных частей молочной кислоты и фенола, при положительной реакции дает окраски коричневых, розово-фиолетовых, лиловых, красноватых оттенков.
  • Карболовая кислота (2,5% раствор фенола) дает красное, желтое, коричневое или фиолетовую окраску. Реакция считается положительной, если окраска появляется в течение 20 минут.
  • α-Нафтол (водно-спиртовой раствор) окрашивает в фиолетовый или красный цвет, реакция проходит за 2-4 минуты.
  • Пирамидон (водный раствор) дает реакцию с появлением в сиренево-фиолетового цвета.
  • Пирогаллол (спиртовой раствор) окрашивает в коричневые тона.
  • Сульфованилин — раствор 1 г ванилина в смеси 8 мл конц. серной кислоты 3 мл дистиллированной воды на свежем материале дает окраску в пурпурные, коричневые, розово-фиолетовые цвета. Впервые применен Арнуольдом и Горисом в 1907
  • Сульфоформалин — смесь формалина и 60-70% серной кислоты. Используется на свежем материале и на образцах, хранившихся в формалине не более 6 месяцев. При положительной реакции медленно появляется коричневую окраску.
  • Феноланилин — смесь 3 капель анилина, 5 капель конц. серной кислоты и 10 мл карболовой кислоты. Положительная реакция заключается в появлении окраски ржаво-розового, пурпурно-красного или лилово-розового цвета, который затем переходит в шоколадно-коричневый.
  • Формалин окрашивает в фиолетово-коричневый или красноватый цвет.
  • 10% раствор хлорида железа (III) дает зеленоватую окраску, что потом переходит в темно-серое.
  • 10% раствор сульфата железа (II) с добавлением серной кислоты окрашивает мякиш в зеленый, оливковый, оранжевый или коричневый цвет.
  • 40% раствор щелочи (гидроксида калия или натрия) дает окраски в розовый, желтый, красно-коричневый или оранжевый цвет, реакция пригодна также для гербарного материала.

Другие методики

Тест на амилоиднисть

Амилоиднистю называют способность структур окрашиваться под действием растворов йода. Обычно применяется реактив Мельцера: к водному раствору, содержащему 2,5% йода и 7,5% йодида калия добавляют равный объем хлоралгидрата. Реакция применяется как макроскопическая, так и для препаратов при микроскопировании, что дает возможность определить амилоиднисть различных структур: спор, гиф, базидий. Амилоиднисть оказывается у образцов, которые длительное время (более 100 лет) хранились в гербарии (по данным Зингера, 1975). Наличие и степень амилоидности позволяет определить особенности строения молекул глюканов — полисахаридов, по строению близких к крахмала, а также мощность глюкановый слоя на поверхности микроскопических структур гриба. В случае сильно развитого поверхностного слоя йод абсорбируется в каналах между глюкановими цепочками. Если цепочки сильно разветвленные, реакция дает желто-коричневую окраску, при наличии менее разветвленных цепочек проявляется собственно амилоидная реакция — интенсивное посинение, аналогичное известной в аналитической химии йодокрохмальнои реакции. Обычно различают структуры неамилоидни (не окрашиваются), декстриноидни или псевдоамилоидни (окрашиваются в желтые и коричневые тона) и амилоидные (окрашиваются в голубой, синий, до почти черного цвета).

В 2005г. В. А. Спирин предложил определять степени градации этой реакции по шкале цветов (в скобках — обозначение цвета по шкале Дж. Петерсена [Petersen, 1996]):

  • слабкодекстриноидна — от бледно-коричневого (P14) до бледно-оливкового (P16)
  • декстриноидна — желтовато-бурый (P9)
  • сильнодекстриноидна — оранжево-бурый (P7)
  • неясно-амилоидная — от бледно-мышино-серого (P53) до бледно-фиолетово-серого (P59)
  • слабкоамилоидна — мышино-серый (P55)
  • амилоидная — от голубовато-серого (P57) до темно-сине-серого (P56)
  • сильноамилоидна — от винно-серого (P58) до серовато-фиолетового (P44)

Реакция Шеффера

Реакция Шеффера: стеклянной палочкой наносят на срез полоску раствора анилина, а затем, пересекая ее, полоску 65% азотной кислоты. При положительной реакции в месте пересечения появляется хромово-желтое пятно, затем окраска переходит в оранжево-красное. Реакция Шеффера — важная внутриродовое признак для рода Agaricus. Пригодна для материала, длительное время хранился в гербарии. Открытая Ю. Шеффером в 1933

Применение красителей

Окраска органическими красителями применяется как для улучшения оптических свойств микроскопических препаратов, так и для характеристики окрашенных структур. Например, при окрашивании Толуидиновый красителями (крезил синий) различают цианофилию — синеватый окраски и метахромазию — красновато-розовый или красновато-фиолетовую окраску.