Гель-электрофорез — аналитический метод химии и молекулярной биологии для разделения различных видов молекул.

Проведение

Исследуемый препарат (смесь веществ, раствор белка, ДНК или РНК) вносят в лунку, размещенную в геле — среде с сетчато-пространственной структурой. Обычно для гель-электрофореза используют тонкие пластины геля. Находясь в буферном растворе макромолекулы обладают определенным суммарным электрическим зарядом, и когда через гель проходит электрический ток, они перемещаются в электрическом поле.

Молекулы одинакового размера (одинакового заряда) движутся единым фронтом, создавая гели дискретные невидимые полосы. Чем меньше размер молекул или больше их заряд, тем быстрее они движутся. Постепенно выходной препарат, состоящий из различных макромолекул, делится на зоны, разделенные на длине пластинки.

За ходом электрофореза следят за перемещением в геле красителя — электрически заряженной низкомолекулярного вещества, которую вносят в каждую лунку перед началом электрофореза. Когда краситель достигает конца пластины, электрофорез останавливают. Если образец представляет собой дискретный набор макромолекул разного размера, то после электрофореза получается набор четких полос, расположенных друг под другом. Если же размещение молекул по размеру более или менее непрерывное, то получается размытая картина. По интенсивности окраски полос можно судить о концентрации макромолекул в образце.

Определение относительной молекулярной массы

Чтобы определить относительную молекулярную массу разделенных фрагментов, одновременно проводят электрофорез маркерных макромолекул с известными молекулярными массами. Набор маркеров должен охватывать весь диапазон молекулярных масс в данной системе. Образец маркерных молекул вносят в отдельную лунку, размещенную вблизи одного из краев пластинки. Логарифм относительной молекулярной массы маркера линейно связан с его электрофоретической подвижностью Rf — величиной, равной отношению расстояний, пройденных маркерной молекулой и красителем. Построив график зависимости логарифма относительно молекулярных масс маркеров от Rf, можно найти относительную молекулярную массу каждого компонента образца. Относительная молекулярная масса измеряется в Дальтона, двухцепочечных нуклеиновых кислот — в количестве пар нуклеотидов, равно цепных — в количестве нуклеотидов.

Разделение нуклеиновых кислот

Для электрофорезной разделения нуклеиновых кислот среднего размера обычно используют агарозном геле. Агароза — это чистая фракция, которую получают из агара или непосредственно с агароутворюючих морских водорослей. В 1,0% агарозном геле можно разделить молекулы размером от 600 до 20000 п.н. Для фракционирования больших молекул ДНК (миллионы пар оснований), денатурированной ДНК и РНК используют специальные системы электрофореза. Иногда для решения специальных задач для разделения ДНК используют полиакриламидные гели. В 20% полиакриламидном геле можно разделить фрагменты ДНК, которые состоят всего из шести оснований и которые отличаются только одним нуклеотидом.

Изображения по теме

  • Гель электрофорез