Г

Гликогенфосфорилазы

Гликогенфосфорилазы (1,4-α-D-глюкан: ортофосфат α-гликозилтрансферазы) — фермент, который катализирует лимитирующий стадию процесса гликогенолиза: расщепление гликогена до глюкозо-1-фосфата путем фосфоролиз.

Гликогенфосфорилазы иногда называют просто фосфорилазы, потому что это первый открытый фермент с фосфорилазною активностью.

История исследования

Гликогенфосфорилазы была первым открытым ферментом класса фосфорилазы. Во время ее исследования впервые установлена ​​возможность регуляции фермента путем фосфорилирования / дефосфорилирования. Гликогенфосфорилазы также была одним из первых известных аллостерических ферментов, и первым, для которого были установлены точные трехмерные структуры активной и инактивированной формы с помощью рентгеноструктурного анализа.

В 1930-х годах Карл и Герти Кори установили, что гилкогенфосфорилаза скелетных мышц может находиться в двух формах, превращаются друг в друга: каталитически активная фосфорилаза a и неактивная фосфорилаза b. Дальнейшие исследования этого фермента проводил Эрл Сазерленд, который выяснил, что фосфорилаза b преобладает в мышцах в состоянии покоя, в то время как фосфорилаза a — во время активных сокращений. Преобразование неактивной формы в активную происходит под влиянием адреналина. 1959 Эдвин Кребс и Эдмонд Фишер установили, что a — и b — формы фосфорилазы отличаются наличием фосфатной группы, присоединенной к остатку серина 14. Высокоточная рентгеноструктурный анализ обоих форм провели Роберт Флеттерик и Луи Джонсон.

Структура гликогенфосфорилазы

Гликогенфосфорилазы — это димер двух идентичных субъединиц длиной по 842 аминокислотные остатки (97 кДа). В состав каждой субъединицы входит аминокинцевий (остатки 1-484) и карбоксикинцевий домены (остатки 485-842). Аминокинцевий домен в свою очередь делится на два поддомены, один из которых содержит место ковалентной модификации (Сер14), аллостерические сайты, и поверхность взаимодействия с другим мономером в Дымере. Второй субдомен содержит сайт связывания гликогена (остатки 316-484).

Активный центр расположен в центре субъединицы между N- и C-концевым доменами. Он удален от сайта связывания гликогена примерно на 30 Å и соединен с ним узкой щелью, в которую помещается 4-5 остатков глюкозы. Эта щель имеет радиус кривизны, соответствующий радиуса спиральной ветви гликогена и слишком узкой, чтобы захватить место ветвления ((α1 → 6) -связь).

Разделение активного сайта и сайта связывания гликогена позволяет ферменту катализировать расщепление многих гликозидных связей в одной молекуле гликогена без надобности отсоединяться и вновь присоединяться к ней. Таким образом увеличивается процесивнисть фермента.

Механизм реакции

Гликогенфосфорилазы катализирует реакцию, в которой ортофосфорная кислота атакует (α1 → 4) -гликозидными связь между ним и предпоследним остатками глюкозы с нередукуючого конца ветви гликогена, в результате чего выделяется глюкозо-1-фосфат. Эта реакция позволяет сохранить большую часть энергии гликозидной связи благодаря формированию эфира.

Реакция должна происходить таким образом, чтобы исключить наличие воды в активном центре, поскольку в противном случае вместо фосфоролиз состоится гидролиз, и на фосфорлиювання образованной глюкозы нужно будет затратить АТФ.

Несколько экспериментальных наблюдений позволяют предполагать о механизме реакции. Во-первых как субстрат (гилкоген) так и продукт (глюкозо-1-фосфат) реакции находятся в α-конфигурации. Если бы происходила прямая атака ортофосфата на гликозидная связь, это сопровождалось бы инвертированием конфигурации C-1 (образовывался бы β-глюкозо-1-фосфат), потому что реакция проходила бы через пентаковалентинй промежуточное состояние. Поскольку α-кофигурация сохраняется, реакция должна происходить в четное количество этапов (в напростишому случае — два), наиболее вероятно, через формирование промежуточного соединения карбкатион (резонирует с ионом оксония).

Во-вторых для протекания реакции фосфоролиз необходимо присутствие кофактора пиридоксаль-5-фосфата (ПЛФ) (производного витамина B 6), присоединенного к Лиз679 через формирование основания Шиффа. Структурный анализ показал, что ортофосфат занимает положение между 5'-фосфатной группой ПЛФ и гликогеном. 5'-фосфатная группа ПЛФ может играть роль общего кислотно-основного катализатора, сначала донуючы протон, а затем превращаясь в его акцептор.

Возможен такой механизм реакции: ортофосфат (в форме HPO2-4) дону протон атома кислорода, образует (α1 → 4) -связь, и одновременно приобретает протона от фосфатной группы ПЛФ. Таким образом формируется переходная соединение карбон-Оксон катион в конформации пивкирсла. Он атакуемого ортофосфат, в результате чего происходит образование глюкозо-1-фосфата и возвращения протона к ПЛФ.

Гликогенфосфорилазы отщепляет по одному остатка глюкозы от нередукуючого конца, пока не приближается к точке ветвления ((α1 → 6) -связи) на расстояние четырех остатков, где ее активность прекращается и может быть восстановлена ​​только после действия дерозгалужуючого фермента.

Термодинамика фосфорилазнои реакции

В реакции, катализируемая гликогенфосфорилазы, большая часть энергии гликозидной связи сохраняется благодаря формированию эфира с фосфатной кислотой. Поэтому стандартная изменение свободной энергии (ΔG 0 ') невелика и реакция может протекать (3,1 кДж / моль) in vitro как в прямом так и обратном направлении. По pH 6,8 равновесие устанавливается при соотношении [ортофосфат] / [глюкозо-1-фосфат] около 3,6. Однако в реальных условиях in vivo это соотношение преимущественно превышает 100, из-за чего равновесие сильно смещается в сторону расщепления гликогена, а реальное изменение свободной энергии ΔG = -8 кДж / моль. То есть фосфоролиз гликогена является екзергоничним процессом.

Регулирования активности фермен

Активность гликогенфосфорилазы является объектом многоуровневых механизмов регулирования. Во-первых, она приводится в соответствие потребностям клетки благодаря действию аллостерических модудяторив. Во-вторых, фермент может включаться / инактивироваться путем ковалентной модификации (фосфорилирования), что осуществляется под воздействием гормонов (глюкагона, адреналина и инсулина), таким образом активность гликогенфосфорилазы меняется в зависимости от потребностей целого организма. В-третьих, изоферментный состав гликогенфосфорилазы отличается в разных органах, в частности у человека есть печеночная, мышечная и мозговая формы, каждая из которых имеет свои особенности регулирования. Это связано с тем, что функции гликогенолиза не одинаковы в разных тканях: например, в мышцах он нужен для обеспечения их энергией во время сокращений, а в печени — для поддержания стабильного уровня глюкозы в крови.

Формы гликогенфосфорилазы

Существует две формы гликогенфосфорилазы, что превращаются друг в друга: в основном активная (Фосфорилированная) фосфорилаза a и преимущественно неактивная (нефосфорильована) фосфорилаза b. Каждая из этих форм в свою очередь может находиться в одном из двух конформаций: каталитически активной расслабленной R (от англ. Relaxed) и каталитически неактивной напряженной T (от англ. Tense). Для фосфорилазы a равновесие смещено в сторону перехода в R-состояние, тогда как большинство фосфорилазы b находится в T-состоянии.

Конформационный переход от T- к R-состояния предусматривает поворот мономеров на 10 ° вокруг оси симметрии второго порядка димера. В результате происходит изменение расположения α-спиралей и выход из активного центра петли, закрывала его в T-состоянии и препятствовала связыванию субстрата. Кроме того происходит поворот боковой цепи остатка аргинина 569 вблизи пиридоксль-5-фосфата, из-за чего увеличивается сродство фермента к ортофосфата. Переход между напряженной и расслабленной формами фермента регулируется связыванием аллостерических модуляторов, которые отличаются в разных тканях.

Алосетрична регуляция гликогенфосфорилазы

В расслабленных мышцах фосфорилаза b преобладает над a форме. Большинство молекул фосфорилазы b находятся в неактивном T-состоянии, однако они могут переходить в R-конформацию под влиянием положительного аллостерического модулятора: АМФ, высокий уровень которого свидетельствует о низком енеретичний статус клетки. Аллостерическим ингибиторами гликогенфосфорилазы b является АТФ, конкурирует с АМФ за связывание с ферментом, и глюкозо-6-фосфат, который обеспечивает отрицательную обратную связь в этом метаболическом пути (конечный продукт подавляет активность первого фермента). Под влиянием гормональных сигналов может происходить фосфорилирования гликогенфосфорилазы, в результате чего она переходит в a форму, активность которой не зависит от аллостерических модуляторов.

Другим путем происходит регуляция активности гликогенфосфорилазы в печени. Поскольку задачей этого органа является поддержание постоянного уровня глюкозы в крови, то печеночный изофермент ингибируется высокими концентрациями глюкозы. Причем аллостерический модулятор действует на a -, а не на b-форму. Гликогенфосфорилазы печени не чувствительна к концентрации АТФ и АМФ, поскольку в гепатоцитах не происходит такого резкого изменения запасов энергии как в мышечных волокнах.

Регуляция путем ковалентной модификации

Кроме аллостерических модуляторов на каталитическую активность гликогенфосфорилазы влияет ковалентная модификация, происходит в ответ на действие гормонов. Преобразование преимущественно неактивной фосфорилазы b в основном активно фосфорилазу a осуществляется благодаря фосфорилированию по остатку серина 14 киназы фосфорилазы. Для обратного перехода необходима активность фосфопротеинфосфатазы 1 (фосфатазы фосфорилазы a). Эти ферменты в свою очередь также подлежат сложным механизмам реглуювання.

Активация фосфорилазы под влиянием глюкагона и адреналина

Гормоны глюкагон и адреналин активируют гликогенфосфорилазы через каскад сигнальных реакций. Первый из них выделяется во время голодания, второй — во время физической активности или ее ожидания. Гликогенолиз в печени чувствителен к действию глюкагона, а в мышцах — до адреналина.

Оба гормона действуют через G-билокспряжени рецепторы: β-адренорецепторов в мышцах и печени и глюкагоновых рецептор в печени. После связывания с лигандом рецепторы передают сигнал триммера G s -билку. Последний активирует мембранный фермент аденилатциклазу, что катализирует образование цАМФ из АТФ. Повышенная концентрация цАМФ вызывает существенное увеличение каталитической активности протеинкианзы А (цАМФ-зависимой протеинкиназы), а та в свою очередь фосфорилирует киназу фосфорилазы. После этого киназа фосфорилазы модифицирует гликогенфосфорилазы b и превращает ее в a-форму.

Кроме фосфорилирования киназа фосфорилазы может включаться также и повышенными концентрациями кальция в цитоплазме, так как содержит в своем составе кальмодулин в качестве регуляторной субъединицы. В мышцах уровень кальция возрастает при сокращений, тогда как в печени это может происходить под влиянием адреналина, действующего через α-адренорецепторов.

Одновременно с активацией киназы фосфорилазы происходит инкативация фосфопротеинфосфатазы 1. Этот белок имеет в своем составе регуляторную субъединицу, в мышцах — G M, а в печени G L. Эти полипептиды крепят каталитическую субъединицу ФФ1 к ее субстратов и гликогена. В мышечных волокнах G M регулируется путем фосфорилирования: протеинкианаза А присоединяет остаток фосфорной кислоты в специфическом сайте 2 (возможно также фосфорилирования другими киназами по сайту 1, что имеет противоположный эффект), что приводит к диссоциации ФФ1 в цитоплазму, где она не имеет доступа к фосфорилазы a и киназы фосфорилазы. Кроме того, в цитоплазме ФФ1 связывается с ингибиторной бликами, также модифицированными протеинкиназой А, в результате чего ее каталитическая активность дополнительно подавляется.

В печени регуляторная субъединица G L ФФ1 не контролируется путем фосфорилирования. Однако ФФ1 прочно присоединяется к фосфорилазы a в R-форме и в таком состоянии неактивной, пока не произойдет переход R → T, в частности под воздействием высоких концентраций глюкозы.

Каскад ферментативных реакций, возникает под влиянием гормонов, обеспечивает значительное усиление сигнала: x молекул гормона вызывают высвобождение в кровь 10000 x молекул глюкозы гепатоцитами. После завершения действия гормонов гликогенолиз должен быстро останавливаться, это обеспечивается фосфопротеинфосфатазою 1, что дефосфорилюе как гликогенфосфорилазы, так и киназу фосфорилазы.

Инактивация гликогенфософилазы под влиянием инсулина и глюкозы

Гормон инсулин является антагонистом глюкагона, он выделяется в кровь в ответ на значительное повышение концентрации глюкозы и стимулирует ее захвата и использования клетками, в том числе и для биосинтеза гликогена. Одновременно с активацией гликогенеза инсулин подавляет гликогенолиз, а именно его ключевой фермент — гликогенфосфорилазы. В мышцах под воздействием этого гормона активируется инсулин-стимулированная протеинкиназа, что фосфорилирует регуляторную G M субъединицы фосфопротеинфосфатазы 1 по сайту 1 (отличный от сайта 2, который является субстратом для протеинкиназы А), что в свою очередь вызывает ее активацию. ФФ1 обеспечивает преобразование активной фосфорилазы a в неактивную b-форму.

В печени кроме инсулина важное значение для подавления гликогенолиза имеет собственный «сенсор глюкозы» — гилкогенфосфорилаза a. В активном R-состоянии она прочно связывает ФФ1 и подавляет ее каталитическую активность, под влиянием повышенных концентраций глюкозы фосфорилаза a переходит в T-конформацию, в результате чего фосфорилированный Сер14 становится удобным субстратом для дефосфорилювання ФФ1. Одновременно снимается ингибирование ФФ1, которая теперь может дефосфорилюваты другие белки.

Эволюция гликогенфосфорилазы

Сравнение аминокислотной последовательности гликогенфосфорилазы кишечной палочки, дрожжей, слизевика Dictyostelium, картофеля, крыс и человека показало наличие трех консервативных последовательностей, подвергшихся очень мало изменений в течение эволюции: 15 аминокислотных остатков, контактирующих с глюкозой в активном центре, почти идентичны во всех исследованных организмов, несколько более вариабельными есть 15 аминокислот, связывающие приридоксальфосфат и сайт связывания гликогена. Такие результаты свидетельствуют о том, что каталитический механизм не изменился в процессе эволюции.

С другой стороны, в регуляторных сайтах наблюдаются существенные различия. В то время как самый тип регулирования — ингибирование глюкозо-6-фосфат, что обеспечивает отрицательную обратную связь, имеющийся в большинстве исследованных организмов, аминокислоты, необходимые для фосфорилирования фермента и связывания нуклеотидов, есть только в гликогенфосфорилазы млекопитающих. Итак, более сложные механизмы контроля ферментативной активности в процессе эволюции возникли позже.

Показать больше

Похожие статьи

Добавить комментарий

Проверьте также
Закрыть
Кнопка «Наверх»
Закрыть
Закрыть