К

Космиды

Космиды (Cosmides) — плазмиды, содержащие фрагмент ДНК фага лямбда включая cos -участок. Вместе с системами упаковки у фагов частицы in vitro используются как векторные молекулы для клонирования генов и при построении геномных библиотек. Космиды были впервые сконсутруювалы Коллинс и Брюнинг 1978 года. Их название происходит от сокращения двух терминов: cos -участок (сам термин в свою очередь происходит от англ. Co hesive end s — липкие концы) и плаз МИДа.

Космиды имеет размер примерно 5 т.п.н. и обязательно включает следующие элементы: cos -участок, необходимую для упаковывание в вирионы фага лямбда, точку ori плазмиды для репликации в клетке бактерии, сайты распознавания эндонуклеазы рестрикции и маркерный ген (например ген резистентности к какому антибиотику).

С помощью космиды клонировать участки ДНК размером 32-47 т.п.Но .. Для этого космиды и чужеродную ДНК обрабатывают одной и той же эндонуклеазой рестрикции, после чего полученные линейные фрагменты смешивают и проводят реакцию лигирования. Далее происходит упаковки ДНК у фагов головки in vitro, она разрезается в cos -участок. Этот процесс сопровождается селекцией фрагментов по размеру, поскольку запаковуватись может только ДНК длиной 78-105% от генома фага лямбда. Таким образом в вирионы попадут преимущественно рекомбинантные космиды, содержащие клонированного участок ДНК. Продукты лигирования между двумя космиды будут малы для упаковки, а между двумя фрагментами чужеродной ДНК — слишком большими.

Полученные Фаговые частицы с рекомбинантными космиды используют для инфицирования клеток кишечной палочки. В цитоплазме космиды циклизуються благодаря соединению липких концов и дальше реплицируются как обычные плазмиды, не проявляя никаких функций фага лямбда. Селекция трансформированных клеток проводится по маркерным геном присутствует в векторной молекуле.

Модификации

Поскольку космиды дают возможность клонировать относительно большие участки ДНК, они удобны векторами для создания библиотек фрагментов геномов эукариот полученных путем частичного расщепления эндонуклеазы рестрикции. Однако продукты такого расщепления могут иметь разный размер, и возможны случаи, когда происходит лигирование двух относительно небольших фрагментов, не находились рядом в геноме, и создание соответствующего клона, который будет давать ложное представление об их положении в хромосомах. Эту проблему можно преодолеть путем фракционирования продуктов частичного расщепления по размеру. Однако даже такой метод не позволяет полностью избежать возникновения клонов космиды, содержащие несколько лигованих фрагментов ДНК, поэтому были предложены другие методы, в частности дефосфорилювання фрагментов чужеродной ДНК, чтобы они не могли объединяться друг с другом. Также были созданы специальные космидни векторы pJB8 (Burke, Ish-Horowicz, 1981) и c2XB (Bates, Swift, 1983), при использовании которых вероятность образования ложных клонов сводится к минимуму.

Современные космиды серий pWE и sCos характеризуются наличием нескольких сайтов клонирования, фланкованой фагов промоторами и уникальными участками распознавания эндонуклеазы рестрикции Not I, Sac II и Sfi I, позволяющие вырезать вставку одним фрагментом.

Показать больше

Похожие статьи

Добавить комментарий

Проверьте также
Закрыть
Кнопка «Наверх»
Закрыть
Закрыть