Т

Трансдукция (генетика)

Трансдукция (от лат. Transductio — перемещение) — форма горизонтального переноса генов, при которой передача генетического материала от одной клетки к другой происходит с помощью вируса (бактериофага в случае бактерий), что, как и в случае других форм горизнотального переноса генов, приводит к изменения наследственных свойств. Вирус, переносит клеточную ДНК или РНК, называется трансдукцийною частицей. Различают два вида трансдукции: общую (генерализованную), при которой может переноситься любой участок генома клетки, специализированная, во время которой всегда переносится один и тот же набор генов. Явление трансдукции было открыто американскими учеными Джошуа Ледерберг и Нортоном Циндером в 1952 году, во время изучения бактерии Salmonella typhimurium и ее паразита фага P22. Явление общей трансдукции используют для картирования геномов бактерий, а также в генной инженерии.

История исследования

В 1952 году Циндер и Ледерберг наблюдали явление генетического обмена между двумя ауксотрофнимы штаммами S.typhimurium, в результате которого создавались прототрофни бактерии. Они показали, что перенос генов происходит без физического контакта между клетками, необходимого для конъюгации, и его прохождению не препятствует добавления ДНКазы к среде, а следовательно этот процесс отличается от трансформации. Агент, ответственный за генетический обмен был способен проходить через бактериальные фильтры, и впоследствии было выяснено, что им является умеренный бактериофаг P22. Это открытие стало возможным из-за счастливый случай: один из штаммов, который использовали Ледерберг и Циндер, был лизогенизований бактериофагом P22. На определенной стадии эксперимента в какой-либо из клеток состоялась индукция профага, после чего сформированные вирусные частицы заразили другой ауксотрофний штамм и перенесли в него гены дикого типа от своего предыдущего живителя.

Впоследствии аналогичный процесс был обнаружен и в других гарм-отрицательных бактерий, в частности Escherichia coli (осуществляется бактериофагом P1), Myxobacteria, Rhizobium, Caulobacter и Psuedomonas. Как для фага P22, так и для фага P1, было показано, что трансдукция является результатом физического переноса ДНК от донора к реципиенту: донорный штамм выращивали в среде, содержащей тяжелые изотопы азота и водорода (2 H и 15 N), которые включались в ДНК во время репликации, то есть новые поколения бактерий содержали «тяжелую» ДНК. Через некоторое время культуру переносили на обычную среду (с 1 H и 14 N) и инфицировали бактериофагами. В таких условиях синтезировалась «легкая» вирусная ДНК. Было выяснено, что некоторые вирусные частицы включают в свою структуру тяжелую, то есть бактериальную, ДНК, когда такие бактериофаги заражали реципиентного штамм, то во многих клетках тяжелая ДНК встраивалась в хромосому.

Общая трансдукция

Общая трансдукция характеризуется тем, что переноситься может любой фрагмент бактериальной хромосомы. Этот процесс требует успешного прохождения двух этапов: образование вирусной частицы, содержит ДНК реципиента, и стабильное введение этой ДНК в клетку донора, последнее чаще всего обеспечивается сайт-специфической рекомбинацией с бактериальной хромосомой.

События в клетке донора

Упаковывание бактериальной ДНК в вирусные головки — это ошибка в процессе репликации вируса. Она может случаться по разным причинам, например, если бактериальная ДНК содержит последовательность очень похожую той, что служит сигналом для начала упаковки в фагов ДНК. В целом процесс формирования трансдукцийних частиц зависит от особенностей метабиолизму ДНК конкретного вида вируса. Чаще всего к трансдукции способны фаги, упаковки ДНК в которых происходит по механизму «полной головки». Лучше всего этот процесс изучен на примере фага P22.

Формирование трансдукцийних частиц фага P22

Геном фага P22 характеризуется конечной избыточностью (то есть крайняя левая последовательность, длиной примерно 2% от всей ДНК, повторяется на правом конце) и циклической пермутации (т.е. участок, повторяется не является постоянной, а отличается в ДНК каждой вирусной частицы). Такие особенности связаны упаковкой вирусной ДНК по механизму «полной головки» (англ. Headful packaging).

Вирусные частицы фага P22 содержат линейную двухцепочечную ДНК с «тупыми» концами, то есть без однонитевая выступлений. Когда, после инфицирования, она попадает в клетку, то, в первую очередь, происходит ее циклизация. Преобразование линейной ДНК в кольцевую осуществляется путем сайт-специфической рекомбинации между правой и левой конечными участками, и возможна только благодаря тому, что эти участки одинаковые, в этом и заключается смысл существования конечной избыточности в геноме фага P22. Далее кольцевая ДНК вируса реплицируется по механизму «кольца катится», в результате чего образуется длинный конкатамер, состоящий из большого количества последовательно соединенных копий генома фага.

Упаковка ДНК в вирусные головки начинается с специфической последовательности pac, здесь фермент, кодируемый вирусным геном, делает первый надрез, который определяет начало упаковки. Длина ДНК, будет упакована, определяется размером головки (отсюда и название механизма), когда последняя наполняется, фермент делает второй надрез. Этот надрез определяет не только окончание формирования первой головки, но и начало формирования второй. То есть ДНК, упаковывается во второй вирион уже не начинается с pac-сайта и ее начало не является специфичным. Третий надрез делается, когда полностью упаковывается второй головка, после чего начинается формирование четвертого вириона. Так что во время упаковки ДНК фага P22 специфическая последовательность необходима только для инициации процесса, далее он происходит независимо от каких-то специфических участков генома. Длина ДНК, упаковывается определяется только размером вирусной головки, и у фага P22 несколько больше чем общая длина генома, из-за чего и возникает конечная избыточность, а поскольку надрезы каждый раз делаются в другой области, то и повторяются в каждой образованной молекуле ДНК различные фрагменты.

Во время инфекции фагом P22 бактериальная хромосома НЕ деградуеться, а значит он также может выступать субстратом для упаковки в вирусные частицы. В геноме S.typhimurium действительно есть 10-15 участков, подобных pac-сайта фага P22, и в них может инициироваться процесс упаковки. Таким образом образовываться вирусные частицы, которые будут нести гены бактерии. Однако трансдукцийни частицы формируются значительно реже чем обычные вирионы, вероятно, из-за того, что хромосомные участки, с которых начинается упаковки бактериальной ДНК, полностью не идентичны pac-сайта вируса. Начиная с каждой из таких последовательностей в головки может запаковуватись 10-15% генома бактерии, однако, чем дальше ген находится от pac-сайта, тем меньше вероятность его попадания в трансдукцийну частицу. Из-за этого некоторые гены S.typhimurium переносятся фагом P22 в тысячу раз реже, чем другие.

Существует HT мутант фага P22, что характеризуется значительно большей частотой формирования трансдукцийних частиц (примерно половина вирусного потомства), чем дикий тип. Вероятность переноса некоторых генов такими вирусами может увеличиваться до 10 000 раз по сравнению с исходным штаммом. HT мутант имеет измененный белок, распознающий pac-сайт. Из-за оползня в специфичности он начинает «отдавать предпочтение» другой, значительно более распространены в геноме бактерии, последовательности. HT штамм часто используют в определенных генетических манипуляциях, для которых требуется трансдукция.

Формирование трансдукцийних частиц другими фагами

Механизм общей трансдукции, выяснен в ходе исследования фага P22, оказался справедливым и для многих других бактериофагов. Например, перенос генетической информации фагом P1 E.coli происходит по такой же общей схеме, которые и в случае P22, однако имеет определенные отличия: во-первых Фаговая головка P1 примерно вдвое больше головку P22, а следовательно вдвое больше и длина ДНК, упаковывается, во-вторых хромосома кишечной палочки содержит значительно больше сайтов инициации упаковки (pac) чем хромосома S.typhimurium. Поэтому колебания частоты трансдукции различных генов значительно меньше в случае фага P1, по сравнению с P22.

К общей трансдукции способны далеко не все бактериофаги, например, вирулентный фаг T4 E.coli вызывает деградацию бактериальной ДНК, а значит в головки может упаковываться только его собственная. ДНК этого вируса содержит модифицированный нуклеотид — гликозилированный гидроксиметилцитозин. Бактериальная хромосома разрушается фагов нуклеазы, что действует только на ДНК с немодифицированным цитозином, в то время как вирусная ДНК остается неповрежденной. В 1979 году был получен мутант фага T4 с дефектной системой дегарадации хромосомы живителя, этот штамм способен эффективно осуществлять общую трансдукции.

Для фага λ характерна способность к специализированной, а не общей, трансдукции. Упаковка ДНК этого вируса происходит не по механизму «полной головки», а есть сайт-специфическим. При упаковке каждый надрез делается только в cos-сайте, причем формируются «липкие концы». Однако было установлено, что на 60-90 минуте литической развития фага лямбда становится возможным упаковывание бактериальной ДНК у фагов головки без распознавания cos-сайтов. Этот процесс подавляется определенной вирусной экзонуклеаза. Мутанты, у которых эта экзонуклеаза «выключена», как и гены, ответственные за лизис, могут использоваться как эффективные агенты для общей трансдукции.

События в клетке реципиента

Трансдукцийни частицы, как и обычные бактериофаги, способны успешно вводить ДНК в бактериальные клетки, при этом инфекция не развивается, поскольку гены ответственные за репликацию вируса отсутствуют. ДНК донора в клетке реципиента может либо встраиваться в хромосому, или оставаться в цитоплазме. В последнем случае, если данный фрагмент ДНК не способен к репликации, он будет со временем утрачен (абортивная трансдукция), если же он может реплицироваться автономно, то передаваться в последующие поколения как Внехромосомная носитель наследственности.

Встраивание донорной ДНК в ДНК реципиента происходит путем гомологичной рекомбинации. По крайней мере в случае фагов P22 и P1 происходит Двухниточный замена фрагмента бактериальной хромосомы на введенную вирусом ДНК, для этого необходимо прохождение двух кроссинговере, по одному на каждом из концов участка, встраиваемый. Если эти кроссинговере проходить посередине интродуцированного фрагмента ДНК, то включаться в хромосому соответствующая лишь его часть. Из всей ДНК, переносится в клетку-реципиент при трансдукции в конечном итоге примерно лишь 5% оказывается в ее хромосоме.

Использование общей трансдукции

Общую трансдукции широко используют для построения генетических карт, то есть для установления последовательности расположения генов, а также расстояния между ними. Для этого используют котрансдукцию двух или чаще трех факторов. Обычно таким методом исследуют гены, расположенные слишком близко, чтобы их последовательность можно было установить методом прерванной конъюгации.

Класс Количество
A + B + C + 50
A + B + C 75
A + B C 3 часа
A + B C 1

Например, если нужно картировать трех близких гены A, B и C в качестве донора использоваться прототроф A + B + C + на культуре которого выращиваться бактериофаги, часть из которых образует трансдукцийни частицы. Полученными фагами заражать ауксотрофний штамм A B C при этом образуется семь классов бактерий, в которых состоялась трансдукция, и один, самый, в котором не произошло, последнего следует избавиться для дальнейших исследований. Самый простой метод — это отобрать клетки, в которых ген дикого типа заменил хотя бы один из локусов, например, пусть это будет ген A. Культуру бактерий выращивать на минимальной среде, с приложенными факторами, необходимыми для ауксотрофы B и C таким образом можно отобрать четыре класса трансдуктантом A + B C -, A + B + C -, A + B C, A B + C +, еще три будут потеряны. После этого реплики полученных культур переносят на полноценную среду без фактора, необходимого для B и на полноценную среду без фактора для C таким образом можно определить, состоялась трансдукция в каждом из этих двух локусов. Теперь можно рассчитать частоту каждого из четырех классов, данные для примера приведены в таблице справа. Из полученных результатов можно сделать вывод, что ген B находится между генами A и С, поскольку редким всегда есть тот, класс, у которого в хромосому встроились два крайних гены, но не средний, потому, что в таком случае должно было состояться не два , а четыре кроссинговера. Однако, результаты, полученные таким методом будут хоть и информативными но неполными, из-за потери трех классов трансдуктантом.

Настоящая зависимость чатсоты котрансдукции от расстояния между генами является нелинейной, поскольку на нее влияют два разных фактора: во-первых, чем ближе расположены два гена, тем реже кроссинговер, необходимый для встраивания ДНК донора в ДНК реципиента, будет проходить между ними, во-вторых, расстояние также влиять и на вероятность упаковывание этих генов в одну фагов головку.

Кроме картирование генов общая трансдукция также может использоваться для комплементацийного анализа, перенос плазмид и транспозонов, конструюювання новых штаммов микроорганизмов.

Специализированная трансдукция

Специализированная трансдукция отличается от общей несколькими чертами: во-первых, во время этого процесса участок ДНК донора в трансдукцийний частице ковалентно присоединена к вирусной ДНК, во-вторых переносятся не любые гены, а только определенная специфическая участок бактериальной хромосомы. Специализированная трансдукция используются как мощный инструмент для манипуляции генами: молекулярного клонирования, картирование отдельных генов и мутаций в них, направленного мутагенеза, комплементацийного анализа и тому подобное.

Формирование трансдукцийних частиц фага лябмда

Лучше изученным примером специализированной трансдукции является трансдукция с помощью умеренного бактериофага λ E.coli. Геном этого вируса представлен линейной Двухниточный ДНК с 12-нуклеотидными «липкими концами». Попадая в клетку бактерии эта ДНК замыкается в кольцо благодаря гибридизации между «липкпимы концами», на места которых формируется cos-сайт. На определенном этапе литической цикла развития фага λ его геном реплицируются по механизму «кольца катится», в результате чего образуются длинные конкатамеры. Во время упаковки ДНК у фагов головки, ферменты, разрезают конкатамер на отдельные фрагменты, действуют сайт-специфически — только в cos -участок, генерируя «липкие концы». Длина ДНК упаковываемого может быть разной — от 35 до 50 т.п.Но ..

Во время лизогенных цикла развития геном фага λ встраивается в хромосому кишечной палочки между галактозы и биотиновим опероном, благодаря рекомбинации между участками aatP (англ. Phage attachment) и aatB (англ. Bacteria attachment), при этом на концах вставки (профага) образуются две новые участки attR (англ. attachment site on the right) и attL (англ. attachment site on the left). В случае индукции профага, он должен вырезаться из хромосомы кишечной палочки. Обычно этот процесс происходит путем рекомбинации между сайтами attR и attL, однако иногда происходит ошибочное, так называемая «незаконная», рекомбинация, в случае которой фрагмент вырезается сдвигается вправо или влево, а значит он будет содержать часть бактериальной ДНК и не будет содержать части вирусной, если при этом cos-сайт НЕ втарчаеться, то такая ДНК может успешно запаковуватись в вирусные головки. Преимущественно трансдукцийни частицы фага лямбда переносят галактозным оперон E.coli, такие фаги сказываются λ gal. Часть из этих вирусов несут все необходимые для литического развития гены, другие являются дефектными и могут развиваться только в присутствии фага-помощника.

События в клетке реципиента

Когда фаг, несущий участок хромосомы донора, заражает клетку реципиента стабильная трансдукция может происходить несколькими путями. Фаг может лизогенизуваты клетку, если у него сохранился сайт attB и ген int, то встраивания происходит аналогично как и в дикого типа. Однако, как правило именно эти участки и теряются в процессе формирования трансдукцийнои частицы, поэтому встраивания происходит иначе, чаще всего путем рекомбинации между участком ДНК донора, принесенной фагом, и гомологической участком в хромосоме живителя. При некоторых условиях геном трансдукцийного вируса может сохраняться в цитоплазме клетки как плазмиды.

Абортивная трансдукция

Абортивная трансдукция — трансдукция, при которой участок хромосомы бактерии, попадает в другую бактериальную клетку, не удваивается при ее последующих делениях, а передается только одной дочерней клетке.

Показать больше

Похожие статьи

Добавить комментарий

Проверьте также
Закрыть
Кнопка «Наверх»
Закрыть
Закрыть