Vault, или цитоплазматический рибонуклеопротеин vault — эукарио органеллы, химически представляет собой рибонуклеопротеин. Под электронным микроскопом эти органеллы напоминают свод купола собора с осью симметрии 39-го порядка. Функции vault плохо изученными, однако на сегодня есть сведения об их участии в различных сигнальных путях клетки. Возможно, vault вовлечены в развитие явления множественной лекарственной устойчивости к противоопухолевой химиотерапии. Они присутствуют во многих типах эукариотических клеток и является висококонсервативнимы среди эукариот.

История изучения

Vault было открыто и успешно выделены из печени мыши в 1986 году клеточным биологом Нэнси Кедерша (англ. Nancy Kedersha) и биохимиком Леонардом Ромом (англ. Leonard Rome) из медицинской школы Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе. Сначала vault были описаны как яйцевидные частички загрязняющих препараты окаймлен клатрином везикул. Частицы были выделены с помощью центрифугирования в градиенте плотности сахарозы и электрофореза в агарозном геле. Оказалось, что они симметричную бочкообразную структуру, похожую на своды готического собора, со что частицы и получили свое название (от англ. Vault — свода). Сначала размер vault оценили в 35 × 35 × 65 нм³, но впоследствии с использованием криоэлектронных микроскопии он был уточнен до 41 × 41 × 72,5 нм³. Таким образом, vault являются крупнейшими из когда-либо описанных цитозольных неикосаедричних нуклепротеинив. В дальнейшем структура vault изучалась с помощью рентгеноструктурного анализа и ядерного магнитного резонанса. В 2009 году структуру vault из печени мыши были определены с расширением 3,5 Å.

Структура vault

Vault — самые рибунуклеопроинови дольки. По размеру они превосходят рибосому и весят около 13 Мда. Vault почти полностью состоят из белков, из-за чего их сложно окрашивать стандартными методами. Белковая часть vault представлена ​​многими молекулами главного белка vault (MVP) (95,8 кДа), на долю которого приходится более 70% всех белков в частице, а также белками VPARP (~192 кДа) s TEP1 (~291 кДа). Кроме этого, в состав vault входят vault РНК (vРНК) длиной 86-141 нуклеотидов. Суммарную массу РНК в vault оценивают в ~460 кДа.

Долька vault достигает около 670 Å в длину и имеет крупнейшей диаметр ~400 Å. Стенка имеет толщину всего 15-25 Å; внутри нее находится полость длиной около 620 Å и максимальным диаметром ~350 Å. Долька состоит из двух симметричных половин, каждая из которых состоит из трех частей: тела, плечевой области и шапочки. Тело содержит 78 копий 9 повторяющихся структурных доменов MVP (39 копий в каждой половине), суженная часть сформирована связанными конец к концу структурными повторяющимися доменами R1. Высота плечевого участка составляет ~25 Å, а диаметр ~315 Å. Шапочки присутствовать на обоих концах частицы, и каждая из них содержит 39 копий домена шапочка-спираль (аминокислотные остатки MVP с Asp647 по Leu802) и домена шапочка-круг (с Gly803 по Ala845). Высота шапочки составляет ~155 Å, а внутренний и внешний диаметры домена шапочка-круг достигают ~50 Å и ~130 Å соответственно.

MVP состоит из 9 повторяющихся структурных доменов (R1-R9). Домены R8 и R9 состоят из пяти антипараллельных β-листов, обозначаемые S1, S2, S3, S4 и S5. В остальных семи доменах есть два дополнительных β-листы (S2a и S2b), вставленных между S2 и S3. По некоторым данным, R1, как и R8 и R9, состоит из пяти антипараллельных β-листов, в то время как в R2 есть два длинных антипараллельных листья между S2 и S3. Каждый домен имеет гидрофобный эффект. Анализ аминокислотных последовательностей показал, что в R3 и R4, возможно, есть два домены типа EF hand. Дальнейшее изучение показало, что MVP взаимодействует с другими белками, такими как PTEN, через вероятные два домена EF hand с участием ионов кальция, впрочем, с этим согласуются ли не все экспериментальные данные.

Плечевая участок (с Pro520 по Val646) сворачивается в один α / β-глобулярный домен с 4 антипараллельными бета-листьями с одной стороны и с 4 α-спиралями с другой. Очевидно, что именно в плечевой области находятся элементы, отвечающие за взаимодействие vault с липидными рафтами.

Домен шапочка-спираль сворачивается в α-спираль из 42 витков, которая заключается в суперспираль. Домен шапочка-круг расположен на конце шапочки и формирует U-образную структуру со спиральными элементами на обоих концах.

vРНК располагаются в шапочках на концах долек vault. Белок TEP1, очевидно, располагается сверху плоской части шапочки, где его участок WD40 repeat формирует структуру типа кольцевого β-пропеллера. N-концевая часть TEP1 содержит 4 повторяющихся домены непонятного функционального назначения, РНК-связывающий домен и ATP / GTP-связывающий домен. Было показано, что TEP1 взаимодействует с теломеразною РНК и ризимы человеческими vРНК. VPARP расположены преимущественно в шапочке vault.

Компонент Характеристика Локус Положения и взаимодействие в vault Функции
MVP 96 копий белка составляют основную массу vault. Способны самоскладатись в vault. Не имеют функций за пределами vault 16p11.2 Тело и шапочка vault, нет необхино партнеров Структурная; руководит связыванием с сигнальными белками
VPARP Слабая поле (АДФ-рибоза) полимераза, частично связана с vault 13q11 Шапочка, непосредственно связываются с N-концевой частью MVP Каталитическая: поле (АДФ) -рибозилювання MVP
TEP1 Связывается с теломеразой и vault; не нужны для теломеразы 14q11.2 Шапочка, непосредственное связывание с MVP Каталитическая: сбор vРНК-мишеней в vault
vРНК hgv1-3, hgv4 НЕ экспрессируется; частично связаны с vault 5q33.11

Xp11.22

Шапочка, связываются с TEP1 Неструктурные, функции плохо изучены

Функции

Широкое распространение vault и их эволюционная консервативность указывают на выгоду присутствия в этих органелл важных биологических функций, хотя о них известно очень мало. Неизвестно ничего о первоначальных функции vault в клетках противостою. Тем не менее, есть несколько теорий относительно роли vault в клетках млекопитающих. Среди них указывается, что особенно большое количество vault присутствует в клетках и тканях, связанных с очисткой организма, например, в макрофагах.

Также было высказана гипотеза, что vault послуговують основными «пробками» в ядерных поровых комплексах. Иммунофлуоресцентный анализ с использованием антитил против vault показал, что в изолированных ядрах клеток печени мыши vault располагаются на поверхности ядерной мембраны. Имуноелектронна микроскопия с использованием вторичных антител, конъюгированных с золотом, показало, что в изолированных ядрах vault являются ассоциированными с ядерными порол комплексами. Поэтому, возможно, vault могут участвовать в ядерноцитоплазматичному транспорте.

В 2005 году было выдвинуто предположение, что человеческие vРНК hvg1 и hvg2 могут связываться с противораковым препаратом митоксантроном, а также играть важную роль в экспорте токсичных соединений. Впрочем, другое исследование показало, что нарушение работы гена MVP у мышей не приводило к усилению чувствительности к цитостатическим препаратам. Более того, мыши дикого типа и дефектные по MVP мыши демонстрировали одинаковую ответ на доксорубицин. Во время еще одного исследования было продемонстрировано, что нокдаун MVP с помощью малых интерферувальних РНК не влиял на удаление доксорубицина из ядра. Кроме того, повышение экспрессии MVP в хемочутливих клетка не усиливало устойчивости к препаратам. Эти результаты свидетельствуют в пользу того, что MVP и vault не вносят непосредственного вклада в устойчивости к цитостатическим агентов.

Ряд исследований показал участие vault в различных сигнальных путях клетки, и количество таких путей постоянно растет. На дрожжевой двогибридний системе было показано, что MVP может связываться с PTEN — белком-угнетение опухолей, который фосфорилирует фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат, негативно регулируя сигнальный путь фасфоинозитид-3-киназы SHP-2, содержит домен SH2 (Src homology 2), и служит скеффолд-белком в сигнальном пути эпидермального фактора роста (EGF). Оказалось, что SHP-2 связывались с MVP, фосфорилированном по остаткам тирозина, и это связывание усилилось под действием EGF. Таким образом, MVP функционирует как скеффолд белок для SHP-2 и киназ, регулируемых внутриклеточно, и регуляция фосфорилирования MVP через SHP-2 может иметь важное значение для выживания клетки. Кроме того, было показано взаимодействие между MVP и доменом SH2 Src в клетках желудка человека и клетках рака шлюнка 253J. Имунопреципитация и имунофлуорисцентний анализ показали, что EGF усиливал взаимодействие между MVP и Src, и она блокировалась под действием ингибитора Src PP2, EGF также стимулирует перемещение MVP из ядра в цитозоль и навколоядерну зону цитоплазмы, где MVP колокализуеться с Src. Есть предположение о роли MVP в качестве нового регулятора Src-опосредованных сигнальных каскадов. Было установлено, что MVP является белком, индуцированным интерфероном γ (IFN-γ): в ответ на IFN-γ наблюдалось значительное повышение уровня мРНК и самого белка MVP. Эта активация привлечена к взаимодействию STAT1 и сайта, активируется IFN-γ, в проксимальном просмотре MVP. Кроме того, IFN-γ значительно усиливал темпы трансляции MVP. Показано, что vault могут взаимодействовать с эстрогеновыми рецепторами при связывании с эстрадиолом и вместе с рецепторами переносятся в ядро. Согласно одним из данных, vault и MVP могут взаимодействовать с инсулиноподобный фактор роста 1, HIF1A, а также заторкуваты два главных процессы репарации двухцепочечных разрывов в ДНК: негомологические соединения концов и гомологичную рекомбинацию. Таким образом, частицы vault функционируют в качестве центральных платформ взаимодействия в клеточных сигнальных каскадах.

VRARP, другой белок, входящий в состав vault, есть поле (АДФ-рибоза) полимеразы.

Необычная структура и своеобразная динамика vault, а также их большие размеры подводят к мысли, что, возможно, vault функционируют в качестве природных наноконтейнеры для ксенобиотиков, нуклеиновых кислот и белков. Проводится работа по разработке рекомбинантных vault, а именно по обеспечению взаимодействия vault с поверхностными клеточными рецепторами и внесения в них различных грузов.

В таблице приведены основные сведения о белках, с которыми взаимодействуют vault:

Белок Характеристика Локус Взаимодействие с vault Функции, связанные с vault
PTEN Белок-супрессор опухолей, главная ингибиторная фосфатаза пути PI3K. Главный субстрат PIP3 10q23.3 MVP (N-конец), Ca 2+ -зависимая взаимодействие Усиление ядерным функций PTEN
SHP-2 Протеинтирозинфосфатаза; активатор роста, опосредованного рецепторными тирозинкиназы (RTK) 3q13.13 MVP (зависимая от фосфорилирования MVP взаимодействие) Стимулирование EGRF-опосредованной MAPK-активности
Erk2 Митоген-тирозинкиназа, которая активизируется; главный передатчик RTK-опосредованных сигналов пролиферации 22q11.22 MVP (зависимая от фосфорилирования MVP взаимодействие) Стимулирование EGRF-опосредованной MAPK-активности
Src (Прото) онкоген, Тирозинкиназа 20q11.2 MVP (зависимая от фосфорилирования MVP взаимодействие) Стимулирование EGRF-опосредованной MAPK-активности
COP1 E3 убиквитинлигаза, у позвоночных уничтожает c-Jun и p53 1q25.1-1q25.2 MVP (фосфорилирования MVP, что уменьшается от УФ-излучения) Подавляет EGF-опосредованную активацию MAPK
Эстрогеновых рецепторов Ядерный рецептор гормона эстрадиола, индуцирует лиган-зависимую транскрипцию генов-мишеней 6q25.1 MVP (гормонозависимых взаимодействие) Ядерный импорт и активация эстрогеновых рецепторов
La РНК-связывающий белок Связывает и защищает 3'-концевые элементы UUU (OH) транскриптов, синтезированных РНК-полимеразы III 2q31.1 vРНК Защита vРНК

Клиническое значение

Рак

В 1990-х годах появились сообщения о том, что vault могут непосредственно бут вовлечены в развитие множественной лекарственной устойчивости у раковых клетках. Оказалось, что белок, связанный с множественной устойчивостью и известный под названием LRP (англ. Lung Resistance-related Protein -, белок, связанный с множественной устойчивостью в легких) на самом деле является человеческим MVP. Во время проведения второго исследования связь между vault и множественной лекарственной устойчивостью был показан на клетках человеческого рака толстой кишки SW-620. Обработка SW-620 бутиратом натрия увеличивала экспрессию MVP и приводила к устойчивости к доксорубицина, винкристина, грамицидина D и паклитаксела. Трансфекция клеток рибозимами, специфичными к MVP, подавляла эти активности.

Свой вклад в развитие множественной лекарственной устойчивости могут вносить и vРНК. В 2009 году было установлено, что некодирующие vРНК могут процесуватись на малые vРНК (svРНК) при участии Dicer, которые дальше функционируют путем РНК-интерференции подобно микроРНК: svРНК связываются с белком семьи Argonaute и негативно регулируют экспрессию CYP3A4 — фермента, принимающего участие в метаболизме ксенобиотиков.

В последние годы накапливаются свидетельства того, что vault связанные с функционированием систем репарации ДНК в клетке, поэтому, возможно, они вносят свой вклад в нечувствительности не только к химиотерапии, но и к радиотерапии рака.

Инфекционные болезни

В 2007 году две исследовательские группы сообщили об участии vault в ответе на инфекции. Оказалось, что в человеческих B-лимфоцитах, зараженных вирусом Эпштейна-Барр, наблюдались повышенные уровни vРНК, которые, возможно, как-то причастны к защите от вируса и / или к транспортным механизмов. Кроме того, было показано, что при зараженные эпителиальных клеток легких человека бактерией Pseudomonas aeruginosa MVP быстро рекрутувався в липидные рафты, где участвует в механизмах усиления врожденной иммунного ответа. Мыши MVP — / — имели в 3,5 раза больше бактерий на грамм легочной ткани, чем мыши дикого типа, и чаще умирали от инфекции, вызванной P. aeruginosa.

Эволюционная консервативность

Vault были описаны у млекопитающих, земноводных, птиц, а также в слизняка Dictyostelium discoideum. Согласно информации из базы данных Pfarm, гомологи белков, входящих в состав vault, обнаруженные у инфузории Paramecium tetraurelia, кинетопластиды, многих позвоночных, актинии Nematostella vectensis, моллюсков Trichoplax adhaerens, плоских червей (а именно Echinococcus granulosus) и хоанофлагелят.

У ряда эукариотических организмов не было выявлено гомологов белков vault. Среди них такие модельные организмы, как растение Arabidopsis thaliana, нематода Caenorhabditis elegans, плодовая мушка Drosophila melanogaster и пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Однако, несмотря на эти исключения, высокая степень сходства vault у разных организмов говорит о том, что эти органеллы имеют определенное эволюционное значение. Согласно последним данным, последний общий предок эукариот имел vault, однако впоследствии они были потеряны у ряда групп, в том числе грибов, насекомыми, возможно, растений.

Изображения по теме

  • Vault органеллы
  • Vault органеллы