Вестерн-блот (англ. Western blot) — широкорозповсюджений лабораторный метод, основанный на реакции антиген-антитело, применяемое для определения специфических протеинов в экстрактах клеток или тканей, предварительно фракционированных с помощью гелевого электрофореза и перенесены, в подавляющем большинстве случаев, на нитроцеллюлозную или PVDF-мембрану. Трансфер протеинов с геля на мембрану позволяет инкубировать их с определенным антителом и выполнить дальнейшую визуализацию полученных бэндов.

История

Вестерн-блот был изобретен Гарри Тоубином (Harry Towbin), который работал в лаборатории Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research. Однако название «вестерн-блот» была дана этому методу другим ученым — W. Neal Burnette, по аналогии с Саузерн-блот — методом определения последовательностей в ДНК с помощью антител, изобрел Эдвин Саузерн; и Нозерн-блотом — с помощью которого можно определить участки в РНК, который изобрел Джордж Страка в Стэнфорде.

Методика вестерн-блота

Приготовление образцов белка

Протоколы изготовления образцов могут существенно отличаться в зависимости от того, есть ли исследуемый белок интегральным или растворимым, есть ли необходимость в сохранении нативной конформации белка и тому подобное. Обычно ткань, из которой необходимо выделить белок, механически гомогенизируют в присутствии мощных детергентов, таких как β-меркаптоэтанол или Тритон Х-100. Обязательным шагом является также измерения общей концентрации белка (по методу Лоури или Брэдфорда) и выравнивание ее в разных образцах путем разведения, что облегчает сравнение конечных результатов.

Электрофорез

Гелевый электрофорез позволяет разделить протеины на фракции, в зависимости от их молекулярной массы — тяжелые движутся в геле медленнее легкие.

Трансфер

Следующим этапом вестерн-блота является перенос белков с электрофорезной геля на носитель, на котором их можно специфически заметить антителами. В качестве носителя обычно используют мембрану, изготовленную из нитроцеллюлозы или PVDF. Для проведения трансфера используется специальное устройство под названием трансблотер. В ранних версиях вестерн-блота переноса белков из геля на мембрану обеспечивалось фильтровальной бумагой, клался в «сэндвич» с носителей и тянул на себя богатый детергенты трансферный раствор за счет капиллярных сил. В настоящее время движущей силой в процедуре трансфера является электрическое поле.

Визуализация

Нитроцеллюлозная и PVDF-мембраны являются сильными сорбентами белков, поэтому перед их инкубирования с антителами проводится процедура блокировки (на лабораторном жаргоне ее также часто называют «забивки») — обработка носителя богатым белком раствором, который свяжется со свободными сайтами на поверхности мембраны и предупредит неспецифическую сорбцию антител. Обычно в качестве белкового раствора используют обезжиренное молоко.

После блокировки мембрана инкубируется с первичным антителом, которое специфически связывается с исследуемым белком. Далее добавляется вторичное антитело, меченое биотином, пероксидазой хрена или радиоактивным веществом, с помощью которого можно выполнить визуализацию полученных бэндов.

Изображения по теме

  • Вестерн блот
  • Вестерн блот
  • Вестерн блот
  • Вестерн блот
  • Вестерн блот
  • Вестерн блот